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YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 V 活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(中文版)

更新時(shí)間:2014-03-26      瀏覽次數(shù):1833

YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(中文版)

主要用途

YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 V(F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶)活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用丙

酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng),測(cè)定與 ATP 合成對(duì)應(yīng)的 ATP 水解產(chǎn)生 ADP 過(guò)程中,伴隨的

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后吸光峰值的降低,即采用光譜法測(cè)定樣品中酶活性的

而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種純化線粒體樣品(動(dòng)

物、人體、酵母)以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的 F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶的特異性活性檢測(cè)??捎糜谛?/span>

肌、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶,嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,

操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定,反應(yīng)優(yōu)化,檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

線粒體呼吸鏈復(fù)合物V,通常稱為ATP合成酶(ATP synthase) F型ATP酶 type ATPase)、(F和F1F0 ATP酶(F1F0

ATPase),是線粒體氧化磷酸化的*反應(yīng)。其分子量為500KD,含有十六個(gè)亞單位,其中兩個(gè):ATP酶6

和8為線粒體DNA編碼的。ATP酶主要有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:F0為質(zhì)子通道,由幾個(gè)膜蛋白構(gòu)成,包括a、b、c、d、

e、F6、A6L、OSCP(oligomycin sensitive conferring protein)等;和F1催化活性結(jié)構(gòu)域,由水溶性的α3β

3γδε蛋白構(gòu)成。其zui特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。復(fù)合物V的主要功能在于產(chǎn)生大部分

細(xì)胞所需的能量ATP。ATP的合成需要線粒體內(nèi)膜電子傳遞到氧分子時(shí),呼吸鏈蛋白所產(chǎn)生的質(zhì)子梯度變化。

質(zhì)子通過(guò)F0結(jié)構(gòu)域傳遞到基質(zhì),激活F1催化活性結(jié)構(gòu)域,促使ATP合成。該酶異常會(huì)導(dǎo)致心肌和神經(jīng)系統(tǒng)

疾病。基于ATP,在寡霉素參與下,受到F1F0 ATP酶的水解,進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)

和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應(yīng)系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide

adenine dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD)

產(chǎn)生的吸光峰值的變化(340nm),來(lái)定量分析F1F0 ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為:

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI 緩沖液(Reagent A)

YIJI 反應(yīng)液(Reagent B)

YIJI 陰性液(Reagent C)

YIJI 底物液(Reagent D)

YIJI 專性液(Reagent E)

產(chǎn)品說(shuō)明書

毫升

毫升

毫升

微升

微升

1

保存方式

保存在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融;YIJI 反應(yīng)液(Reagent B),避免光照,有效保證 6 月

用戶自備

比色皿:用于光譜分析的容器

1

 

分光光度儀:用于光譜分析

培養(yǎng)箱:用于孵育反應(yīng)物

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化;YIJI 反應(yīng)液(Reagent B)注

意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、 測(cè)定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品(例如純化線粒體樣品等),置于冰槽里(注意:檢測(cè)前溶解線粒體;參見注意事項(xiàng) 4)

2. 設(shè)定好分光光度儀(溫度為 30℃):波長(zhǎng)為 340nm,間隔 30 秒,讀數(shù) 11 次(共 分鐘),并置零

二、 背景對(duì)照測(cè)定

1. 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液(Reagent A)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液(Reagent B)

3. 加入 xx 微升 YIJI 底物液(Reagent D)

4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 3 分鐘

5. 加入 xx 微升 YIJI 陰性液(Reagent C)

6. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在 秒之內(nèi))

7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照:340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 -340 波長(zhǎng)讀數(shù) 分鐘或 分鐘

三、 樣品總活性測(cè)定

1. 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液(Reagent A)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液(Reagent B)

3. 加入 xx 微升 YIJI 底物液(Reagent D)

4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 3 分鐘

5. 加入 100 微升待測(cè)樣品(注意:10 微克總線粒體蛋白;樣品須溶解;參見注意事項(xiàng) 4)

6. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在 秒之內(nèi))

7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品總活性讀數(shù):340 波長(zhǎng)讀數(shù) 分鐘 -340 波長(zhǎng)讀數(shù) 分鐘或 分鐘

四、 樣品非特異活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開始前,移取 100 微升待測(cè)樣品(注意:10 微克總線粒體蛋白;樣品須溶解;參見注意事項(xiàng) 4)到 1.5

毫升離心管,加入 xx 微升 YIJI 專性液(Reagent E),混勻后,放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 15 分鐘。然

后置于冰槽里備用

1. 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液(Reagent A)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液(Reagent B)

3. 加入 xx 微升 YIJI 底物液(Reagent D)

4. 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 3 分鐘

2

 

5. 加入 120 微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品

6. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在 秒之內(nèi))

7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品非特異活性讀數(shù):340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 -340 波長(zhǎng)讀數(shù) 1 分鐘或 5 分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

1)樣品活性(總活性和非特異活性)

【(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X 1(體系容量;毫升)X 樣品稀釋倍數(shù)】÷【0xx(樣品容量;毫升)Xxx(毫

摩爾吸光系數(shù) X 1 或 5(反應(yīng)時(shí)間,分鐘)】=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克

單位=微摩爾 NADH/分鐘

2)樣品特異活性

樣品總活性測(cè)定-樣品非特異活性測(cè)定=樣品特異活性

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為 21 次操作(10 個(gè)樣本),包括 次背景對(duì)照

2. 操作時(shí),須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過(guò)程中,背景測(cè)定只需 

4. 線粒體樣品檢測(cè)前,須溶解;建議超聲處理(20 秒 X 3 循環(huán);50%功率)或凍存融解(-70℃至 37℃)

循環(huán) 次或使用 YIJI 線粒體溶解試劑盒-GMS10018

5. 建議線粒體懸液使用 0.25 M SUCROSE 和 2 mM EDTA,pH9.0;忌用磷酸緩沖溶液

6. 建議使用線粒體裂解懸液,而不是細(xì)胞裂解懸液。如果使用細(xì)胞裂解懸液,*須澄清;第二須加 50

微克

7. 加入樣品后 秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定

8. 反應(yīng) 分鐘后光譜測(cè)定值趨于穩(wěn)定;測(cè)定值由高到低變化;測(cè)定可以持續(xù) 分鐘

9. 測(cè)定值由高到低變化,即 分鐘測(cè)定讀數(shù)高于 分鐘或 分鐘測(cè)定讀數(shù),表明有酶活性

10.光譜測(cè)定后,比色皿須清洗*

11.建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為 10 微克/100 微升;如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高,則可以增加或降低樣

本量;注意計(jì)算公式的調(diào)整(本公司提供 YIJI 線粒體溶解試劑盒 GMS10018 為后續(xù)的線粒體蛋

白濃度測(cè)定的預(yù)處理試劑盒和 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 GMS30030.1)

12.樣品特異活性是指寡霉素敏感的 ATP 合成酶,去除其它干擾因素(例如復(fù)合物 I/II/III/IV 等)

13.線粒體呼吸鏈復(fù)合物 V 酶活性單位濃度定義:在 30℃溫度下,pH 7.5 條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化 

摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14.本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確

3

 

 

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