YIJI 活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
YIJI 活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)鈣黃綠素－鈷技術(shù)，選擇性地
聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到細(xì)胞漿的熒光染料，即刻發(fā)生熒光淬滅，來(lái)分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞線粒體（動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等）膜通道孔活性（瞬時(shí)或長(zhǎng)期開(kāi)放狀態(tài)）的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過(guò)膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開(kāi)放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過(guò)度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開(kāi)放，而造成細(xì)胞色素 C 的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素－AM，又稱雙甲亞胺二酸鈉熒光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis－carboxymethyl amino methyl fluorescein）－acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量 622kd，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結(jié)合性；第三，不是線粒體酶的底物；第四，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM 進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生具有極性的熒光性強(qiáng)的鈣黃綠素。鈣黃綠素進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲。同時(shí)胞漿內(nèi)的鈣黃綠素受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開(kāi)放，鈣黃綠素釋放出來(lái)，被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓?，表明膜通道孔的開(kāi)放狀態(tài)。
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI 清理液（Reagent A）     毫升
YIJI  染色液（Reagent B）    微升
YIJI  中和液（Reagent C）    毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)                   1份
保存方式
保存YIJI染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在 4℃冰箱里;有效保證6月
用戶自備
24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器
1.5 毫升離心管：用于染色工作液配制和細(xì)胞染色的容器
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析
細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI中和液
（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出毫升離心管，加入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
一、 貼壁細(xì)胞染色
1． 準(zhǔn)備 1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng) 24 孔板的待測(cè)細(xì)胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm 培養(yǎng)皿，和其微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新的 1.5微升 YIJI 中和液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為 YIJI 染色工作液，置入它培養(yǎng)孔板，見(jiàn)注意事項(xiàng) 8）
2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
3． 小心沿著孔壁加入
養(yǎng)孔表面
4． 小心抽去清理液
5． 小心沿著孔壁加入
微升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 中和液（Reagent C）的
YIJI 染色工作液到 1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
6． 放進(jìn) 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育 20 分鐘，避免光照
7． 小心抽去 YIJI 染色工作液
8． 小心沿著孔壁加入
9． 小心抽去清理液
10． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 8 和 9 一次
11． 小心沿著孔壁加入 500 微升 37℃預(yù)熱的 YIJI 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
12． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：
激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，散發(fā)波長(zhǎng) 505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
（B）
增強(qiáng)
二、 懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色
1． 將懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞（1 X 106 細(xì)胞）移入到 1.5 毫升離心管
2． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
3． 小心抽去上清液
4． 加入
微升 37℃預(yù)熱的 YIJI 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
5． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
6． 小心抽去上清液使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：
微升 37℃預(yù)熱的 YIJI 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
微升 37℃預(yù)熱的 YIJI 清理液（Reagent A）到 1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，散發(fā)波長(zhǎng) 505nm――RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）
7． 加入微升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和YIJI 中和液（Reagent C）的 YIJI 染色工
作液，充分混勻

8． 放進(jìn) 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育 20 分鐘，避免光照
9． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
10．小心抽去上清液
11．加入微升 37℃預(yù)熱的 YIJI 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
12．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
13．小心抽去上清液
14．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 11 至 13 一次
15．加入微升 37℃預(yù)熱的 YIJI 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析（每隔 5 分鐘檢測(cè)一次，持續(xù) 30 分鐘） 波長(zhǎng) 488nm 氬離子激光，：觀察 50000個(gè)細(xì)胞以上――
波峰左移，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
b)或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：
16．選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
1）移取 10 微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片（每隔 5 分鐘檢測(cè)一次，持續(xù) 30 分鐘）
2）激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，散發(fā)波長(zhǎng) 505nm――
綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
c)或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：
1）移取 500 微升上述細(xì)胞懸液到 1 毫升比色杯
2）加入 500 微升 YIJI 清理液（Reagent A）
3）上下傾倒混勻數(shù)次
4）放進(jìn)熒光分光光度儀（每隔 5 分鐘檢測(cè)一次，持續(xù) 30 分鐘） 激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，：散發(fā)波長(zhǎng) 505nm――
RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為 20 次（0.5 毫升體系/次）操作
2． 所有操作均須無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行
3． 操作時(shí)，須戴手套
4． 染色前，所有試劑溶液，除 YIJI 染色液（Reagent B）外，需 37℃預(yù)熱
5． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
6． 孵育時(shí)，必須避免光照
7． 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
8． 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm 培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)
整處理液：
操作容器          建議操作體系
載玻片            100 微升
載玻片培養(yǎng)皿       1 毫升
35mm 培養(yǎng)皿        1 毫升
96 孔培養(yǎng)板        100 微升
48 孔培養(yǎng)板        200 微升
24 孔培養(yǎng)板        500 微升
12 孔培養(yǎng)板        1 毫升
6 孔培養(yǎng)板         2 毫升
25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶   3 毫升
9． 如果不具備 505nm 散發(fā)波長(zhǎng)的濾波器，可以使用 505nm 至 530nm 中的任一波長(zhǎng)
10．如果膜通道孔為瞬時(shí)開(kāi)放（transient），則熒光緩慢且自發(fā)降低
11．本公司提供膜通道孔抑制劑：YIJI 0.2 毫摩爾環(huán)胞素 A（cyclosporine A）－GMS12226，維護(hù)熒光完整
12．本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰