組織培養(yǎng)再生的步驟

更新時(shí)間：2013-03-18

瀏覽次數(shù)：1605

返回列表

一、接種

組織培養(yǎng)的接種是指將滅過菌的材料，在無菌的情況下，切成小塊，放入培養(yǎng)基的過程?？蒲?、生產(chǎn)部門的接種工作，多在無菌室或超凈工作臺上進(jìn)行，中學(xué)可制作接種箱，在箱內(nèi)進(jìn)行接種。接種的方法步驟如下：

1、在無菌室或接種箱中放好接種時(shí)所需要的酒精燈、貯存70%酒精和棉球的廣口瓶、各種鑷子、接種針、解剖刀、手術(shù)剪、火柴、培養(yǎng)基等。

2、在無菌室或接種箱內(nèi)用紫外燈滅菌（無菌室照射20～50分鐘，接種箱照射15分鐘）。

3、放入已滅菌的接種材料（用培養(yǎng)皿盛?。?。同時(shí)，操作人員用酒精棉球擦手，并對接種工具用酒精燈火焰燒灼。

4、用手術(shù)刀片將材料切割成若干片段，并迅速接種入培養(yǎng)基中。接種時(shí)，錐形瓶（或試管）應(yīng)斜向火焰，在酒精燈火焰附近操作。

5、材料接種好后，將錐形瓶瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)燒一遍，蓋好瓶蓋，注明材料名稱及接種日期。

材料接種后，應(yīng)置于26～28℃的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。

二、植株誘導(dǎo)

本階段是組織培養(yǎng)中zui重要的一環(huán)。在培養(yǎng)基中植物激素的作用下，外植體通過三條途徑迅速增殖，這就是側(cè)芽增殖、誘導(dǎo)不定芽的形成和誘導(dǎo)胚狀體的形成。

1、側(cè)芽增殖

種子植物的每個(gè)葉腋中通常都存在著腋芽，在一定條件下可以使它生長?，F(xiàn)在知道頂端優(yōu)勢抑制側(cè)芽生長，可被外源的細(xì)胞分裂素打破，所以在利用側(cè)芽增殖這條途徑時(shí)，培養(yǎng)基中幾乎都要加入細(xì)胞分裂素（有時(shí)也加入少量生長素）。由于細(xì)胞分裂素的持續(xù)作用，側(cè)芽不斷分化和生長，逐漸形成芽叢。如果反復(fù)切割和轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，就可在短期內(nèi)得到大量的芽。側(cè)芽增殖的主要優(yōu)點(diǎn)是能保持遺傳的穩(wěn)定性，因?yàn)榍o尖的細(xì)胞常是均一的二倍體細(xì)胞，它不易受培養(yǎng)條件的影響而發(fā)生變異，也易于保持嵌合體的性狀。目前已有近百種植物可以用這種方法進(jìn)行繁殖，如草毒（Fragaria ananassa Duch.）、蘋果、葡萄（Vitis vinifera L.）、唐菖蒲（Gladiolus gandavensis Houtt.）、非洲菊、月季（Rosa chinensis Jacq.）、甜菜（Beta vulgaris L.）和鳳梨（Ananas comosus（L.） Merr.）等。關(guān)于培養(yǎng)基中加入細(xì)胞分裂素的濃度，是0.1～10.0毫克/升，一般為1.0～2.0毫克/升。在幾種細(xì)胞分裂素中用的zui多的是6-芐基嘌呤，其次是激動(dòng)素和異戎基腺苷，玉米素用的很少。除了細(xì)胞分裂素之外，在培養(yǎng)基中還經(jīng)常加入低濃度的生長素以促進(jìn)腋芽的生長。常用的生長素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸（濃度為0.1～1.0毫克/升）。

2、不定芽的誘導(dǎo)形成

在自然條件下，很多種植物的器官可以產(chǎn)生不定芽。在培養(yǎng)條件下，由于所需要的外植體很小又加上激素的作用，可以使這種產(chǎn)生不定芽的能力得到*的發(fā)揮，如秋海棠或非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha Wendl.）用常規(guī)的葉插法繁殖時(shí)，每片葉只能產(chǎn)生幾個(gè)到十幾個(gè)芽，但用葉切段在培養(yǎng)基中可產(chǎn)生成千上萬個(gè)芽。在培養(yǎng)條件下，還能使自然條件下不產(chǎn)生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜（Brassica oleracea L.var.capi-tata L.）和番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的葉、菊花[Dendranthema morifolium（Ram.） Tzvel.]的花和葉片、百合（Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker）和水仙的鱗片以及萱草（Hemerocallis fulva L.）的花莖等。在誘導(dǎo)外植體形成不定芽時(shí)，一般使用細(xì)胞分裂素高于生長素比值的激素配比，少數(shù)情況下也采用二者比值接近1的配比。常用的細(xì)胞分裂素是6-芐基嘌呤，激動(dòng)素和玉米素，濃度范圍一般在0.1～10.0毫克/升。生長素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其濃度范圍與細(xì)胞分裂素相同。為了使外植體形成不定芽，外源激素的供應(yīng)只是一個(gè)方面，器官分化的性質(zhì)還要決定于內(nèi)源激素的狀況。因此，對于不同的植物，使用的激素種類和濃度常有較大的變化。在具體操作時(shí)，應(yīng)參考已有資料或相近種類的已有結(jié)果，以確定適當(dāng)?shù)臐舛群团浔取?nbsp;

3、胚狀體的誘導(dǎo)形成

在自然界只有少數(shù)植物可以由珠心產(chǎn)生胚狀體。在培養(yǎng)條件下，現(xiàn)在已有30多個(gè)科的150多種植物可以產(chǎn)生胚狀體。在誘導(dǎo)胚狀體的形成時(shí)，其外植體一般取自胚、分生組織或生殖器官。為了獲得胚狀體，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中應(yīng)含有豐富的還原氮，并加入生長素（主要是2，4-D）誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生。待胚狀體發(fā)生后，要轉(zhuǎn)移到降低濃度或沒有生長素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使胚狀體成熟和生長。

胚狀體途徑的優(yōu)點(diǎn)是增殖率高，而且胚狀體既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根這一步驟。但目前很多重要作物還不能形成胚狀體，或產(chǎn)生的胚狀體難以形成植株，另外胚狀體遺傳性也容易發(fā)生變異，所以目前除柑桔（Citrus）、油棕（Elaeis guine-ensis Jacq.）和咖啡（Coffea）等少數(shù)作物外，都不采用這一途徑。

三、生根

生根是獲得完整植株的一個(gè)關(guān)鍵。通過側(cè)芽和不定芽途徑產(chǎn)生的芽長成嫩枝后（此時(shí)的嫩枝叫試管苗），必須誘導(dǎo)生根才能移植。促使試管苗生根的方法通常有兩種。一種是在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。當(dāng)試管苗長到2～3厘米高時(shí)，將它從基部切下，轉(zhuǎn)移到只含0.2～0.5毫克/升的萘乙酸或吲哚丁酸的固體培養(yǎng)基上生根。另一種是浸泡的方法，將切下的無根試管苗泡在含有高濃度生長素溶液中，生長素濃度為100毫克/升左右，浸泡時(shí)間從幾小時(shí)到1天，然后取出接種于不加任何激素的MS培養(yǎng)基上，十天左右即可生根。

以上兩種方法，在更換培養(yǎng)基后，經(jīng)過幾天，都要將試管苗的瓶口打開，上蓋1～2層紗布，以便于通氣。并要適當(dāng)加強(qiáng)光照，以增加試管苗的自養(yǎng)能力。

四、移栽

當(dāng)試管苗的根原基突起或形成幾毫米長的短根時(shí)，將其取出，洗去瓊脂，載入有少量營養(yǎng)的人工基質(zhì)中。移栽后，保持高濕度，避免陽光直射和過大的溫度波動(dòng)，經(jīng)過一段逐步鍛煉的過程，再定植到土壤中。

在移栽過程中，試管苗的環(huán)境條件發(fā)生了劇烈的變化，其本身又從異養(yǎng)變到自養(yǎng)，葉的光合作用和根的吸收作用需要逐漸發(fā)展。因此移栽時(shí)要小心控制，使試管苗逐步鍛煉，zui終能在土壤中生活。