YIJI細胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑是一種旨在通過機械或化學處理，差速以及等密度離心方法，從動物細胞或軟組織中分離出完整的活性高爾基體細胞器組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種動物細胞或組織（人體、老鼠、兔子等）樣品中活性高爾基體的制備?？梢员挥糜谑荏w循環(huán)、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗體釋放機制等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。

技術(shù)背景

高爾基體（Golgi apparatus或Golgi body），又稱為高爾基復合體（Golgi complex），是大多數(shù)真核細胞的細胞器組分，由40至100扁平片層或稱為小池（cisternae）堆疊成內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system），分成正側(cè)或內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡（cis-Golgi network）、近內(nèi)中間網(wǎng)絡（medial-Golgi）、內(nèi)腔網(wǎng)絡（endo-Golgi）、外側(cè)或反側(cè)網(wǎng)絡等（trans-Golgi）細胞內(nèi)小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，其主要功能在于由內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡接受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡中的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子，處理（修飾、分類）和組裝后，由外側(cè)網(wǎng)絡轉(zhuǎn)運分泌到目標位置。同時也是合成蛋白聚糖（proteoglycan）和碳水化合物的重要場所。高爾基體的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的常用手段之一：*，通過機械或化學方法破裂組織細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，可以通過等密度離心獲得高爾基體。 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   100毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    30毫升

YIJI分離液A（Reagent C）    30毫升

YIJI分離液B（Reagent D）    30毫升

YIJI保存液（Reagent E）    70毫升

YIJI活性液（Reagent F）   200微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存YIJI活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（YJ12028）或PBS緩沖溶液（YJ12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于細胞脫離

*細胞培養(yǎng)液（YJ12052）：用于中和胰蛋白酶的細胞培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

8毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品制備

4℃超速離心機：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

平式搖蕩儀：用于混勻

3號針筒和18號針頭：用于收集樣品

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI活性液（Reagent F）凍融，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

細胞樣品

• 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
• 移入一個15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的3毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI活性液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心15分鐘，速度為3000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取3毫升的YIJI分離液A（Reagent C）到8毫升超速離心管 
• 小心加入3毫升的YIJI分離液B（Reagent D）在YIJI分離液A（Reagent C）的上面，避免震動
• 輕輕加入2毫升上述高爾基體混勻液在YIJI分離液B（Reagent D）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心4小時，速度為100000g
• 小心取出超速離心管：可見樣品和YIJI分離液B（Reagent D）交界處棕色或乳黃色樣品帶
• 小心收集高爾基體樣品帶到8毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）
• 加入6毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液（注意：為白色或絮狀沉淀，較為松散）
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• 組織樣品
• 手術(shù)取出動物組織，避免或去除脂肪組織，秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時） 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的3毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI活性液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心15分鐘，速度為3000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取3毫升的YIJI分離液A（Reagent C）到8毫升超速離心管 
• 小心加入3毫升的YIJI分離液B（Reagent D）在YIJI分離液A（Reagent C）的上面，避免震動
• 輕輕加入2毫升上述高爾基體混勻液在YIJI分離液B（Reagent D）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心4小時，速度為100000g
• 小心取出超速離心管：可見樣品和YIJI分離液B（Reagent D）交界處棕色或乳黃色樣品帶
• 小心收集高爾基體樣品帶到8毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）
• 加入6毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液（注意：為白色或絮狀沉淀，較為松散）
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次（1克動物組織或5 X 107細胞）操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI分離液A/B（Reagent C/D）和YIJI保存液（Reagent E）
• 樣品處理避免使用EDTA，否則影響分離效果
• 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進行
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整YIJI分離液A/B（Reagent C/D）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 通常5 X 107細胞或1克動物組織的高爾基體含量為15微克蛋白

11． 本產(chǎn)品所獲得的高爾基體純度和產(chǎn)量zui為理想

12． 高爾基體的標志蛋白是UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-glactosyl transferase）；建議使用YIJI純化高爾基體UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-glactosyl transferase）活性比色法定量檢測試劑盒－YJ50414.3

• 本公司提供系列亞細胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的高爾基體維持正?；钚?/span>
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶